Práctica 5: Determinación de esporas y cápsulas

INTRODUCCIÓN:

Wirtz-Conklin es la técnica más empleada para teñir las esporas, ya que se requiere una tinción con calor para favorecer la penetración de los colorantes porque tienen varias cubiertas impermeables.

Las cápsulas, debido a su composición química, son difíciles de teñir, por lo que se usa la tinción de nigrosina (tinta china).

OBJETIVOS:

• Aprender a hacer Wirtz-Conklin y la tinción de cápsulas.
• Saber identificar la presencia de cápsulas y esporas.

MATERIALES:

• Mechero de alcohol x2 (uno en la campana y otro en la mesa de trabajo).
• Campana extractora (Botón FAN - luz ultravioleta (10-15 min) - luz de trabajo).
• Balanza de precisión.
• Probeta x2 (una para la safranina, y otra para el verde malaquita).
• 1 tubo Falcon (para la nigrosina).
• Gradilla.
• Pinzas de madera.
• Microscopio.
• Asas de siembra desechables x4.
• Agua destilada.
• 4 bacterias: Bacillus subtilis, Escherichia coli, Staphylococos epidermis, Klebsiella pneumoniae.
• Pipeta Pasteur.
• Pipeta de vidrio de 10 ml.
• Micropipeta 100-1000 μl.
• Puntas azules desechables.
• 4 portaobjetos.
• 2 cubreobjetos (para la tinción de cápsulas).
• Cubeta de tinciones.
• Vaso de precipitados.
• Disolución de safranina al 2,5%.
• Disolución de verde malaquita al 5%.
• Disolución de nigrosina al 10%.

`PROCEDIMIENTO:

Procedimiento de Wirtz - Conklin (esporas):

Hace falta preparar dos disoluciones, una de verde malaquita al 5%, y otra disolución de safranina al 2,5 %.

Verde malaquita al 5%:

• Se quieren 3ml de disolución, por tanto: 3 ml * 0,05% = 0,15 ml verde malaquita, o lo que es lo mismo: 150 μL (0,15 ml * 1000).
• Se necesitan: 150 μL verde malaquita + 2,85 ml de agua destilada.

Safranina al 2,5%:

• El volumen final es de 6 ml, por tanto: 6 ml * (2,5 ml/100 ml) = 0,15 ml. O también: 150 μL de safranina (0,15 ml * 1000).
• El volumen restante son 5,85 ml de agua destilada.

Los μL de verde malaquita y safranina se cogen con una micropipeta de 100 - 1000 μL y puntas azules desechables, y los ml de agua destilada se pueden coger con una pipeta de vidrio de 10 ml.

Una vez listas las disoluciones, se rotulan los 2 portaobjetos con el nombre de una bacteria, para que depués en la campana se sepa que placa de petri va con cada porta.

En la campana, con una pipeta Pasteur, se coloca una gota de agua destilada en el porta y con una asa de siembra se cogen las bacterias de la placa de petri, para depués extenderlas en el porta. Las bacterias se fijan con el mechero de alcohol, con movimientos suaves y sin dejar el porta mucho tiempo expuesto al calor.

Las bacterias son: Bacillus subtilis y Staphylococos epidermis.

Tinción de esporas (en la mesa de trabajo):

• Se cubre con verde malaquita 5% 10 minutos sobre el mechero de alcohol.
• Lavar el exceso con agua destilada.
• Cubrir con safranina 2,5% durante 1 minuto.
• Lavar con agua destilada.
• Se deja secar y se visualiza al microscopio.

Procedimiento de nigrosina o tinta china (cápsulas):

Se necesita una disolución de safranina y otra disolución de nigrosina:

Safranina al 2,5%:

• El volumen final es de 6 ml, por tanto: 6 ml * (2,5 ml/100 ml) = 150 μL de safranina.
• El volumen restante son 5,85 ml de agua destilada.

La disolución de safranina se realiza igual que en el procedimiento anterior y si ha sobrado algo se aprovecha. 

Nigrosina al 10%:

0.5 ml * (10g/100 ml) = 0.05g nigrosina + 500 μL de agua destilada.

Se pesan los 0,05 gramos en la balanza de precisión, y luego con la micropipeta de 100 - 1000 μL y las puntas azules desechables, se coloca el agua.

En la campana, con una pipeta Pasteur, se coloca una gota de agua destilada en el porta y con una asa de siembra se cogen las bacterias de la placa, se extienden en el porta, y se fijan con el mechero de alcohol.

Las bacterias son: Escherichia coli y K. pneumoniae.

Tinción de cápsulas:

• Se cubre con safranina 2,5% durante 1 minuto.
• Se lava con agua destilada.
• Se cubre con nigrosina al 10% (una gota o dos son suficientes).
• Se deja secar y se observa al microscopio.

Lo siguiente es un vídeo propio realizando el procedimiento (duración 4:46).

RESULTADOS:

Staphylococos epidermis:

INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS:

A las otras tres muestras resultó imposible sacarles una foto, ya que no se consiguió ver nada al microscopio. 

Ya que no se ha podido obtener un buen resultado, a continuación se observan algunas fotos de como deberían haberse visto las bacterias al microscopio.

Las tres primeras fotos corresponden a la tinción de Wirtz - Conklin (esporas), mientras que las tres últimas son de la tinción de nigrosina (cápsulas).