Práctica 10: Batería API

INTRODUCCIÓN:

La batería de pruebas API20E es un sistema de identificación rápida de bacterias.

Consta de 21 test bioquímicos estandarizados y miniaturizados. Este sistema presenta las ventajas de ser rápido, eficaz y de permitir realizar numerosas pruebas a la vez. Cada tira de API20E contiene 20 microtubos o pocillos con distintos sustratos deshidratados, y cada tubo es una prueba bioquímica distinta.

OBJETIVOS:

• Aprender a realizar una galería/batería API20E.
• Determinar que microorganismo se presenta en la numeración resultante.  
• Interpretar la serie numérica resultante con la ayuda de la tabla con la numeración correspondiente a cada microorganismo.

MATERIALES:

• Vaso de precipitados con agua destilada.
• Micropipeta de 100-1000 μl.
• Puntas azules.
• Tubo de base cónica.
• Gradilla.
• Rotulador permanente.
• Pipeta Pasteur x6.
• Galería API20E.
• Soporte para la galería.
• Ficha de lectura.
• Bacteria: Klebsiella pneumoniae.
• Papel con los resultados positivos y negativos y nº de identificación de cada microorganismo.
• Hornillo.
• Parafina.
• Alveolos.
• Estufa.
• Campana extractora (Botón FAN - luz ultravioleta (10-15 min) - luz de trabajo).

PROCEDIMIENTO:

Todo el procedimiento se debe llevar a cabo en la campana extractora, pero en este caso la bacteria que se va a manipular es inocua, es decir, no es perjudicial para la salud. 

1. Hay que hacer una dilución, y se prepara una gradilla con un tubo de base cónica, un vaso de precipitados con agua destilada y una pipeta de vidrio de 5 ml.

2. Se echan 4,5 ml de agua destilada en el tubo de base cónica.

3. Con una micropipeta de 100-1000 μl, se echan 500 μl del medio líquido de la bacteria en el tubo y se agita.

4. La galería API 20E se coloca sobre el soporte y se preparan los materiales (gradilla con la dilución, parafina derretida en el hornillo y dos pipetas Pasteur).

Hay que tener en cuenta que:

• Las pruebas ADH, LDC, ODC, H2S y URE deben tener parafina.

• Las pruebas CIT, VP y GEL se deben rellenar hasta la cúpula.

• La prueba ONPG se va a observar con un cambio de color en el medio.

• Las pruebas GLU, MAN, INO, SOR, RHA, SAC, MEL, AMY y ARA, al ser azúcares, el pH del medio se acidifica y, si el resultado es positivo, el medio cambia a un color amarillo.

5. Con una pipeta Pasteur se coge parte de la dilución y se empiezan a echar 2-3 gotas en los 21 pocillos.

6. Se derrite la parafina en el hornillo y, con otra pipeta Pasteur, se sella la cúpula de las cinco pruebas antes mencionadas. Hay que ser rápido antes de que la parafina se enfríe (este paso se hace con la galería en horizontal).

7. Se coge los alveolos y, con una pipeta Pasteur nueva, se rellenan todos los pocillos con agua destilada, se pone la galería encima y por último se coloca la tapa.

8. Hay que incubar durante 24 horas a una temperatura de 36º.

9. El segundo día se retira la galería de la estufa y se preparan tres reactivos con sus tres pipetas Pasteur correspondientes.

• Del reactivo 1 (Kovacs) se echan 5 gotas en el pocillo Ind, y se espera 2 minutos.
• Del reactivo 2 se echan 2 gotas en el pocillo de VP.
• Y del reactivo 3 se echan dos gotas en el pocillo de TDA.

10. En una hoja se anotan todos los resultados positivos y negativos, sumando 1, 2 o 4, hasta obtener un número de siete dígitos. El número obtenido se compara con la bacteria en estudio.

Preparación de los reactivos:

Preparación KOH de la prueba de VP:

El KOH tiene un peso molecular de 56 g/mol y una pureza del 85%. Se necesitan 100 ml con una concentración de 0,5 M.

Primero se calculan los moles necesarios de KOH:

M = n/V --> n = M*V --> n = 0,5 M*0,1L --> n = 0,05 mol KOH.

Se calculan ahora los gramos de KOH que hacen falta:

0,05 mol KOH * (56g KOH/1mol KOH) * (100g KOH/85g KOH) = 3,29 g KOH.

Preparación del nitrato de hierro (II) para la prueba del TDA:

El Fe(NO3)2 tiene un peso molecular de 404 g/mol y una pureza del 98%. Hace falta preparar una disolución de 100 ml con una concentración de 0,02 M.

Lo primero es calcular los moles necesarios:

M = n/V --> n = M*V --> n = 0,02 M*0,1L --> n = 0,002 moles Fe(NO3)2.

Por último, calculamos los gramos de Fe(NO3)2:

0,002 mol Fe(NO3)2 * (404gFe(NO3)2/1molFe(NO3)2) * (100g Fe(NO3)2/98 Fe(NO3)2) = 0,82 gramos Fe(NO3)2.

Ahora se puede ver el vídeo (4:23) de las integrantes de este grupo realizando el procedimiento.

RESULTADOS:

INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS:

El número de identificación obtenido ha sido: 5316721, no era el esperado, debido a que ha podido haber alguna contaminación del medio o por contaminación cruzada. Las bacterias también han podido ser la causante de un resultado erróneo, debido a que han estado un tiempo prolongado en el medio líquido y por eso su estructura bacteriana ha podido producir algún cambio.

Mientras que, el número que corresponde a Klebsiella pneumoniae es 1214773.

Ahora se pueden ver dos fotos de como se debería haber visto el resultado.